Fungal Infections

Cultivo

El método más directo y generalmente concluyente de establecer el diagnóstico de una infección fúngica es sembrar una muestra clínica obtenida del paciente, y que el hongo crezca en dicho cultivo. Se pueden sembrar numerosas muestras como sangre, LCR, pus, orina, tejidos, muestras respiratorias (esputo, lavado de broncoscopia) líquido pleural, pericárdico, peritoneal, piel, pelo, uñas, exudado oral, vaginal., etc. El procesamiento de estas muestras puede requerir centrifugación o lisis para favorecer la siembra en el medio de cultivo. Existen varios manuales que describen específicamente los métodos empleados. Sin embargo, existen pocos estudios comparativos para identificar los que son óptimos. 

La importancia de la selección del medio de cultivo

La recuperación de la mayoría de los hongos aumenta si la muestra se cultiva directamente en los denominados “medios para hongos”. Algunos hongos no crecen, o lo hacen excepcionalmente, en medios de cultivo para bacterias. Como ejemplos, Histoplasma, Mucorales y Coccidioides spp. El cultivo de Aspergillus spp. en medios bacterianos tiene una rentabilidad 30% menor que en medios para hongos [1].

Los medios habituales que se utilizan para recuperar hongos son el Sabouraud, el agar extracto de Malta y con menor frecuencia el caldo corazón cerebro. Para prevenir la contaminación del medio con bacterias, se utiliza el cloranfenicol pero impide el crecimiento de Actinomyces. Para reducir la contaminación ambiental de las placas de medio de cultivo por hongos se utiliza la cicloheximida, pero reduce la recuperación de muchos hongos oportunistas incluyendo Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Mucorales. Por tanto, si la cicloheximida es utilizada hay que incluir en paralelo una placa sin ella.

Medios selectivo e identificación presuntiva

Existen ciertos medios especiales en los que se puede sembrar directamente la muestra clínica, y permiten la identificación presuntiva de ciertos hongos por la morfología que adquiere la colonia o separar colonias en cultivos mixtos. Entre ellos está el agar alpiste  que es útil para identificar Cryptococcus spp. en cultivos de muestras respiratorias de pacientes HIV o el agar cromogénico para la identificación parcial de las especies de Candida

ChromAgar

Chrom Agar para identificar:  1=Candida albicans; 2= Candida krusei; 3=Candida tropicalis

ChromAgar

 

Chrom Agar :1= C. glabrata; 2= C. albicans 3= C. krusei; 4=C. tropicalis

Hemocultivos para hongos

Existen numerosos sistemas de hemocultivos que se utilizan para recuperar hongos de la sangre, incluyendo los estándar para bacterias y otros más especializados, como la lisis centrifugación, Septi-Check, y botellas especiales en sistemas automáticos (a veces de micobacterias y hongos). Se han hecho un limitado número de comparaciones entre ellos, y la elección está condicionada cuando los agentes potencialmente infectantes incluyen Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Penicillium marneffei. En los actuales sistemas automáticos de hemocultivos, Candida glabrata crece más lentamente y más a menudo en la botella anaerobia, y por tanto ambas botellas, aerobia y anaerobia, se deben de utilizar. La recuperación de los hongos es más elevada si los pacientes no están tomando antifúngicos [2] y si al menos se cultivan 20 ml de sangre.

Condiciones de incubación

La temperatura de incubación estándar para los hongos es 30ºC en un ambiente húmedo durante 21 días. Se deben inspeccionar diariamente durante una semana, y al menos 3 veces por semana durante los siguientes 15 días. Algunos hongos crecen muy lentamente como por ej. Histoplasma spp. y pueden requerir un mayor tiempo de incubación. El cultivo de las muestras respiratorias a 42ºC previene el crecimiento de Candida spp. y permite a las especies de Aspergillus desarrollarse sin competencia. 

Manipulación de los cultivos y procedimientos de identificación.

Cuando las colonias del hongo son visibles, hay que inspeccionar su morfología cuidadosamente. Las levaduras se pueden identificar por su forma de crecimiento en medios especiales, como el agar maíz o por su patrón bioquímico. Se puede hacer también una identificación presuntiva en base al color y morfología de la colonia cuando se siembran y crecen en medios de cultivo cromogénicos. Existen métodos rápidos de identificación que son adecuados. Hay diversas publicaciones que comparan dichos métodos.

Los hongos filamentosos son difíciles de identificar. Si no producen conidias o esporas, la única diferencia que se puede encontrar es si las hifas son septadas o no. Si no lo son probablemente sea un Zygomycete (Mucorales, Basidiobolus ranarum o Conidiobolus spp.). Existen medios de cultivo que favorecen la esporulación de los hongos filamentosos como el agar patata dextrosa. Si el hongo no las produce. la única forma de identificarlos es mediante análisis molecular. Una vez que el hongo esporula se puede identificar mediante la observación macroscópica y microscópica con azul de lactofenol de sus características, de forma que personal experimentado puede llegar a saber a que género pertenece sin muchos problemas. La identificación al nivel de especie, puede ser muy difícil o incluso imposible, si no se analiza el color y la morfología en medios de cultivo especiales, como crece a diferentes temperaturas, etc. La secuenciación de fragmentos de DNA logra alcanzar la identificación en casi todas las ocasiones. Se han descrito muchas especies crípticas (idéntica apariencia morfológica pero no molecular) en mucho géneros.

Infecciones de laboratorio por hongos

A la mínima sospecha de que el hongo crecido sea un patógeno primario como Coccidioides spp., Histoplasma spp., Blastomyces dermatitidis, Penicillium marneffei. las placas de medio de cultivo no se pueden manipular fuera de las zonas de contención adecuadas. Se han descrito casos de infección adquirida en el laboratorio con consecuencias graves. Recientemente, se han publicado las medidas que hay que tomar si se abre un placa inadvertidamente con unos de estos hongos [3].

Existen numerosos libros en los que se describe con detalle la identificación de los hongos.

Interpretación del cultivo

El crecimiento en cultivo de un hongo proveniente de una muestra clínica apoya la existencia de infección. Por ejemplo, un cultivo positivo de Trichophyton spp., Microsporum spp. Cryptococcus neoformansCoccidioides spp., Histoplasma spp., Blastomyces dermatitidis, Penicillium marneffei es sinónimo de enfermedad. Las dos excepciones más comunes son Aspergillus spp. y Penicillium spp. Ocasionalmente otros patógenos, como Rhizopus pueden ser contaminantes o colonizadores de las muestras y no patógenos. Además, Candida albicans se puede recuperar de la boca, orina o esputo y no estar causando infección en ese momento. La interpretación de estos cultivos se recoge en la tabla de más abajo:

Interpretación de los cultivos positivos de Aspergillus, Candida y Penicillium spp. ( Ref: Borman & Johnson 2014)

Muestra

Aspergillus

Candida

Penicillium

Sangre

Raro, puede ser significativo o un contaminante de laboratorio

Patógena y hay que tratar (raras excepciones debida a colonización de la piel)

No significativo, contaminante de laboratorio

Catéter venoso

Raro, puede ser significativo o un contaminante de laboratorio

Probablemente significativo, candidemia probable, posiblemente silente

No significativo, contaminante de laboratorio

Tejido

Significativo, si la histología lo confirma

Significativo, si la histología lo confirma

Significativo, si la histología lo confirma

Pus o aspiración de una zona estéril

Significativo

Significativo

Raro, puede ser significativo o un contaminante de laboratorio

LCR

Significativo

Significativo

Probablemente una contaminación de laboratorio

Orina

Raro pero puede ser significativo

Generalmente no significativo. En pacientes inmunocomprometidos o ingresados en la UCI puede significar candidosis invasora

 

Esputo, otras muestras respiratorias

A menudo es significativo – alergia, enfermedad crónica o invasora, especialmente si A. fumigatus

Rara vez es significativo

No significativo. Puede serlo en alergia

Secreción peritoneal tras cirugía

Raro, probable contaminación de laboratorio

A menudo significativo, peritonitis por Candida

Raro, probable contaminación de laboratorio

Líquido de DPCA

Raro pero puede ser significativo

Significativo y grave

Raro, probable contaminación de laboratorio

Uñas

Si las afectadas son las del primer dedo, probablemente significativo

Probablemente significativo, si está afectado el surco ungueal o la onicomicosis es superficial y blanquecina

Contaminación de laboratorio o de la piel

Exudado ótico

Probablemente significativo, si A. niger. Si A. fumigatus hay que considerar otitis invasora.

Probablemente significativo

Contaminación de laboratorio o de la piel

Raspado corneal

Probablemente significativo

Probablemente significativo

Raro, probable contaminación de laboratorio

[1] Horvath JA, Dummer S. The use of respiratory-tract cultures in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Am J Med. 1996;100:171-8.

[2] Kami M, Machida U, Okuzumi K, Matsumura T, Mori Si S, Hori A, Kashima T, Kanda Y, Takaue Y, Sakamaki H, Hirai H, Yoneyama A, Mutou Y. Effect of fluconazole prophylaxis on fungal blood cultures: an autopsy-based study involving 720 patients with haematological malignancy. Br J Haematol. 2002;117:40-6.

[3] Stevens DA, Clemons KV, Levine HB, Pappagianis D, Baron EJ, Hamilton JR, Deresinski SC, Johnson N. Expert opinion: what to do when there is Coccidioides exposure in a laboratory. Clin Infect Dis. 2009;49:919-23.

 

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