Fungal Infections

En muchos aspectos, la microscopía es esencial para la micología. Tiene 3 usos principales:

1. Detección directa del hongo en muestras clínicas – la apariencia de ciertos hongos puede ser muy característica, ej. Un Zygomycete o una tinta china de  un LCR. El examen directo positivo es más rápido que un cultivo;
2. Un examen directo positivo confirma que la recuperación, en cultivo, de un hongo ambiental como Aspergillus es la causa de la infección con poca probabilidad de que sea un contaminante;
3. La identificación clásica de los hongos está basada en la observación microscópica de su morfología.

La sección desarrollada más abajo es bastante técnica y específica. Está dirigida al técnico de laboratorio que desea mejorar sus conocimientos en la detección de hongos mediante microscopía y el informe de los mismos.

Esta tabla recoge las principales muestras clínicas y los probables hallazgos cuando se hace un examen directo

Muestra

Hongo detectado y apariencia

Comentarios

LCR

Levaduras de Cryptococcus

Tinta china.

Pelo, uñas, raspado cutáneo

Hifas de dermatofito o de otro hongo filamentoso

Candida

Varios hongos causantes e indistinguibles. A menudo, los cultivos  son negativos por lo que la microscopía es la única evidencia de infección

Moco de los senos paranasales

Hifas en el moco es diagnóstico de rinosinusitis fúngica eosinófilica

El moco tiene que ser fijado y teñido como en histopatología. Las hifas pueden ser difíciles de ver

Secreción/raspado ótico

Hifas, generalmente con cabezas esporuladas típicas de Aspergillus niger

Ocasionalmente mixta con Candida y levaduras.

Raspado corneal para queratitis

Se pueden ver levaduras u hongos filamentosos

Signo temprano de queratitis fúngica. No se distinguen los hongos causantes.

Aspiración de tejido o biopsia

Hifa de hongo filamentoso

Candida u otras especies

Esférulas de C. immitis

Algunos hongos muy característicos como las blastoconidias pequeñas sin hifas sugestivas de C. glabrata,  o hifas no septadas de Zygomycete.

Secreciones respiratorias

Levaduras sin significado

Hifas (sin levaduras) consistentes con enfermedad

Pneumocystis jirovecii

Hifa generalmente septada y típica de Aspergillus Si no tiene septos, considerar zygomycosis o mucormycosis.

La inmunofluorescencia es superior para P. jirovecii

Extensión de sangre o médula ósea

Levaduras intracelulares típicas of Histoplasma o raramente de Penicillium

En el 40% de la histoplasmosis diseminada es positiva

Líquido peritoneal

Levaduras o rara vez hifas

Útil para confirmar la peritonitis por Candida

Exudado vaginal

Candida albicans (blastoconidias e hifas) o Candida glabrata

Test diagnóstico clave

Grano de micetoma

Pueden verse hifas características

No suele ser definitivo en relación a la especie causante

Tinciones

La utilización de KOH al 10-20% es la preparación microscópica más antigua. Ayuda a disolver la queratina y permite la visualización directa de los hongos pero con una limitada evaluación morfológica. La tinción de Gram es menos sensible. La tinción de Papanicolau puede ser útil. Las extensiones citológicas se pueden teñir con tinciones de plata. La inmunofluorescencia es el mejor método para detectar Pneumocystis. Las tinciones fluorescentes (blanco de calcofluor, blancofor o Tinopal UNPA-GX) que se unen a la quitina de la pared fúngica, son métodos rápidos de despistaje para detectar hifas. Se ven mejor las estructuras fúngicas. 

El papel diagnóstico de la microscopía en ciertas enfermedades

LCR y meningitis

Mediante la tinción de tinta china, las células encapsuladas de Cryptococcus se pueden detectar en el LCR u otros líquidos y secreciones. En pacientes con meningitis, la tinta china es positiva en el 50% de los que son HIV negativo pero sube al 80% en los HIV+. Los linfocitos intactos se pueden confundir con Cryptococcus. En pacientes con SIDA, el LCR puede estar lleno de Cryptococcus, pero las cápsulas pueden ser pequeñas, lo que hace difícil su reconocimiento. Cuando se observe en el LCR, de forma persistente, células de Cryptococcus solo hay que considerar fallo terapéutico o recaída en pacientes en tratamiento cuando se acompañe de deterioro clínico o los cultivos sean positivos. 

Tinta china de un LCR con numerosas blastoconidias con cápsulas grandes y gemación de base estrecha típica de C. neoformans


Microscopía electrónica de transmisión de C. neoformans de cápsula pequeña, en el LCR de un paciente con SIDA. Estas células, de cápsula pequeña se pueden confundir con linfocitos.

Un hongo filamentoso en el LCR de un paciente con meningitis. En el cultivo creció Candida albicans

Pelo

Las muestras del cuero cabelludo deben incluir raíces de pelo, contenido de los folículos pilosos y descamación cutánea. Excepto en el Favus, la porción distal del cabello no contiene hongos. Por esta razón, cortar los cabellos y no arrancarlos con las raíces no es de ninguna utilidad. Un método útil para tomar muestras del cuero cabelludo es el cepillado de la cabeza.

En el examen directo del material obtenido se suelen observar artroconidias del dermatofito colocadas fuera (ectotrix) o dentro del pelo (endotrix). Las artroconidias pueden ser pequeñas (2-4 mm de diámetro) o grandes (hasta 10 mm de diámetro). La descamación cutánea suele contener hifas y artroconidias. En el Favus (infección por T. schoenleinii), los pelos afectados tiene cadenas sueltas de artroconidias con huecos llenos de aire. Las costras (scutulum) que aparecen tienen micelio, neutrófilos y células dérmicas.

Examen directo con blancofor de un raspado cutáneo que tiene hifas.

Uñas

La calidad de la muestra obtenida es un factor determinante del éxito del examen directo y del cultivo. La toma de la muestras no tiene por que ser dolorosa, exceptuando las molestias que puede ocasionar la obtención subungueal de la misma. La figura de más abajo recoge los sitios apropiados para la toma de muestras.

Las muestras obtenidas con un escalpelo romo se puede transportar en un trozo de papel doblado y asegurado con un clip, aunque también hay disponibles comercialmente kits de toma de muestras. El examen directo se hace añadiendo a una parte de la muestra, una solución de KOH al 20-30%. Se deja que se macere y disuelva la queratina de la uña, de forma que pueda ser examinado al microscopio. Alternativamente, una parte de la muestra se puede examinar con la solución para disolver uñas que contiene un fluorocromo [2]. Un ejemplo de cómo preparar una solución es: disolver 1 g de NA2S en 7,5 ml de agua destilada y añadir subsecuentemente 2,5 ml de etanol. Posteriormente se añaden a la mezcla, 10 ml de blancofor o 20 ml de una solución acuosa al 1% de tinopal UNPA-GX (Fluorescent brightner 28; F3543; Sigma)

Moco de los senos paranasales

En una muestra tomada de la nariz o del seno paranasal, la presencia de mucina eosinófila con hifas es una característica diagnóstica de la rinosinusitis fúngica alérgica (AFRS). No puede haber evidencia de que hay invasión tisular por el hongo. Las hifas pueden ser escasas y puede llevar un tiempo considerable visualizarlas con las tinciones utilizadas. Sin este hallazgo, se suelen hacer otros diagnósticos, incluyendo rinosinusitis alérgica (ARS) o rinosinusitis eosinófila mucinosa (EMRS). La utilización de técnicas mas sensibles, como la tinción de quitina o las tinciones inmunofluorescentes anti Alternaria mejoran las tasas de diagnóstico. Otras características que apoyan el diagnóstico, son la presencia de cristales de Charcot-Leyden, erosión ósea y opacidad heterogénea con expansión del seno en el TAC.

Otitis externa

Se obtiene detritus y secreciones del conducto auditivo externo. En el examen directo se ven hifas ramificada, blastoconidias o ambas. En caso de aspergilosis, se pueden ver las típicas cabezas con esporas.

Raspado corneal para el diagnóstico de la queratitis

La queratitis fúngica es una emergencia médica y debe ser sospechada y tratada rápidamente. Para el diagnóstico microbiológico, la mejor muestra es material de la lesión de la córnea; se debe hacer un raspado corneal de la zona ulcerada o una biopsia cuando el epitelio está intacto y la infección solo afecta al estroma corneal. El raspado corneal se obtiene, por ejemplo, con una espátula de platino, una cuchilla Beaver , un cuchillo Bard Parker nº 15 o un cuchillo para cataratas romo). Los hisopos de algodón son menos útiles para desbridar la escara corneal. Se deben tomar varias muestras de la base y los bordes de la zona ulcerada en la córnea. Si el material obtenido se ha sembrado en una placa de medio de cultivo estéril, la misma espátula o cuchilla se puede utilizar nuevamente en la obtención de más muestra. Sin embargo, si el material se ha depositado en un portaobjetos no estéril para el examen directo, la cuchilla debe cambiarse por una nueva y la espátula puede ser flameada, enfriada y utilizada de nuevo.

El examen microscópico directo de muestras corneales teñidas es el método más rápido de conseguir un diagnóstico presuntivo. Hifas septadas hialinas pueden representar Aspergillus, Fusarium o Acremonium. También se pueden ver hifas coloreadas de phaeohyphomycetes como Curvularia. Ocasionalmente, Candida spp. es el causante de la queratitis y entonces se pueden ver blastoconidias e hifas, lo que sugiere esa etiología. El microscopio confocal puede ser una forma más directa de establecer el diagnóstico. 

a
a. Raspado corneal teñido con azul de lactofenol, en el que se ven hifas que pueden corresponder a Fusarium spp. o a Aspergillus spp. Dr Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Otro raspado corneal teñido con azul de lactofenol, en el que se ven hifas septadas con engrosamientos. No son típicas de Fusarium spp. o a Aspergillus spp. y más consistentes con un hongo dematiáceo.

Tejidos y líquido peritoneal

La detección microscópica de blastoconidias, seudohifas y/o hifas de especies de Candida en secciones de tejido o en líquidos estériles es indicativo de candidosis invasora. C. glabrata solo produce blastoconidias, y únicamente C. albicans produce hifas verdaderas. 


Tinción de Gram de orina centrifugada con C. albicans. Se ven blastoconidias e hifas.



Esférulas de Coccidioides immitis en un aspirado de una articulación crónicamente inflamada en un paciente mejicano residente en California

Muestras respiratorias

El examen directo del esputo es útil en la ABPA, ya que se suelen ver hifas con eosinófilos y cristales de Charcot Leyden. Ocasionalmente, se puede diagnosticar infecciones fúngicas raras mediante el examen directo, al detectar esférulas o blastoconidias grandes que sugieren Blastomyces dermatitidis. Se pueden ver Aspergillus o hifas de otros hongos filamentosos en el lavado bronquial cuando hay una traqueobronquitis. A veces, se pueden ver incluso cabezas de Aspergillus. En la aspergilosis invasora la microscopía tiene un rendimiento superior al cultivo cuando se examina el lavado broncoalveolar. Sin embargo, es dependiente del método utilizado y del centro donde se realice. No hay estudios comparativos del rendimiento de la microscopía y el cultivo. 

Examen microscópico directo con KOH de un tapón de moco de un paciente con ABPA en el que se visualiza un entramado de hifas hialinas ramificadas típicas de Aspergillus

Examen microscópico directo con blancofor (izquierda) y KOH (derecha) de un lavado broncoalveolar en el que se ven hifas hialinas septadas consistentes con Aspergillus.

Examen directo con KOH de una secreción respiratoria en el que se ven hifas sin septos típicas de un Zygomycete

El diagnóstico de la neumonía por Pneumocystis (PCP) depende de la microscopía, de la PCR o de la histopatología de biopsias. Las muestras apropiadas para su análisis son el lavado broncoalveolar (BAL) aspirado traqueal, cepillado bronquial, punción percutánea transtorácica con aguja, líquido pleural y transbronquial o biopsia de pulmón. El esputo inducido solo es útil si es positivo o lo que es lo mismo, un esputo negativo no descarta la PCP.

Para alcanzar el diagnóstico hay que visualizar los típicos quistes de ocho núcleos o los trofozoítos de P. jirovecii en alguna de las muestras mencionadas más arriba. En muchas ocasiones, puede haber grandes acúmulos de P. jirovecii, lo que hace difícil distinguir entre los diferentes ciclos de vida del hongo. Además se visualizan células colapsadas mezcladas con intactas. A diferencia de otros hongos, P. jirovecii no se divide mediante gemación, por lo que puede ser distinguido de variantes pequeñas de Blastomyces dermatitidis, Candida glabrata, Cryptococcus species deficientes en cápsula e Histoplasma capsulatum. Las tinciones de Giemsa y Wright detectan los quistes y los trofozoítos, pero no tiñen la pared celular. La plata metenamina, el PAS, el blanco de calcofluor y el azul de toluidina tiñen la pared celular. Los trofozoítos y los quistes también se pueden detectar mediante inmunofluorescencia directa e indirecta usando un anticuerpo monoclonal anti P. jirovecii conjugado con fluoresceína. Dependiendo del monoclonal elegido, se tiñe solo la forma quística o todas las formas. Se ha publicado la rentabilidad de las tinciones para el diagnóstico de la PCP y se han encontrado diferencias [1]

Tinción

Nº de positivos

Nº Total de examinados

SEN (%)

ESP (%)

VPP (%)

VPN (%)

BC

48

308

74

100

98

93

MF

59

310

91

95

82

98

DQ

31

307

48

100

97

88

GMS

50

310

77

99

96

94

La sensibilidad (SEN), especificidad (ESP), el valor predictivo positivo (VPP) y negativo (VPN) para el blanco de calcofluor (BC), Merifluor Pneumocystis (MF), Diff-Quik (DQ), y tinción de GMS.

A veces, no se ven quistes pero la infección se detecta mediante PCR con una gran carga de microorganismos. En muestras respiratorias teñidas con Papanicolau, el organismo se mezcla con el fondo mucoso azul verdoso y es muy difícil de visualizar. En secciones de tejido teñidas con H&E, la PCP se presenta como exudados espumosos eosinofílicos dentro del alveolo. El organismo no se tiñe.

Inmunofluorescencia de un BAL con Pneumocystis jirovecii [3]

Extensión de sangre o médula ósea

La poca sensibilidad del examen microscópico directo de una extensión de sangre o médula ósea no justifica el tiempo que se emplea en examinarla, salvo cuando se sospecha una histoplasmosis diseminada o una infección por Penicillium marneffei, en general en pacientes con SIDA. Se pueden ver pequeñas levaduras dentro de los monocitos mediante una tinción de Wright. Puede ser difícil distinguir entre estos dos hongos pero Penicillium marneffei se divide por fisión y por tanto se puede ver una pared intracelular que divide transversalmente la blastoconidia.

Tinción de Wright de una extensión de sangre de un paciente con histoplasmosis diseminada en la que se ven levaduras intracelulares.

Vaginitis por Candida

El diagnóstico de vaginitis depende de la combinación de los típicos signos y síntomas y de la demonstración del hongo mediante examen microscópico directo o su aislamiento en cultivo. El cultivo es mucho más sensible y adecuado (aprox. 90%) que el examen microscópico (aprox. 40%). Mediante un hisopo se toman muestra de las secreciones vaginales y de la pared vaginal lateral y se envían al laboratorio en un medio de transporte. En el 40% de los casos se ven blastoconidias con/sin filamentos. La sensibilidad aumenta si se examina con blanco de calcofluor u otra tinción fluorescente.

Gránulos de micetoma

El diagnóstico del micetoma depende de la identificación de los gránulos. Es preferible obtenerlos de una fístula cerrada mediante una aguja estéril. Se debe presionar en el trayecto fistuloso para obtener su contenido, incluyendo los gránulos, y se deposita en un portaobjetos. Cada gránulo se debe separar, lavar en 70% alcohol y luego en suero salino antes de ser cultivado. El examen microscópico directo de los gránulos, en KOH al 20%, confirma el diagnóstico de micetoma además de revelar si está causado por un hongo o un actinomiceto. Los gránulos negros sugieren un hongo; los blancos pequeños sugieren Nocardia y los blancos grandes del tamaño de la cabeza de un alfiler pueden deberse a un hongo o a un actinomiceto. Los gránulos pequeños rojos son específicos de Actinomadura pelletieri, pero los blanco amarillentos pueden deberse a un actinomiceto o a un hongo. Los gránulos de los actinomicetos contiene filamentos muy finos (<1mm de diámetro), mientras que los fúngicos contiene masas de hifas cortas y entrelazadas (2-4 mm de diámetro) que a veces son pigmentadas.

[1] Denning DW, Evans EGV, Kibbler CC, Richardson MD, Roberts MM, Rogers TR, Warnock DW, Warren RE.  Fungal nail disease: a guide to good practice (Report of a Working Group of the British Society for Medical Mycology). Br Med J 1995; 311: 1277-1281.

[2] Monod M, Baudraz-Rosselet F, Ramelet AA, Frenk E. Direct mycological examination in dermatology: a comparison of different methods. Dermatologica. 1989;179(4):183-6. PMID: 2695355

[3]Procop GW, Haddad S, Quinn J, Wilson ML, Henshaw NG, Reller LB, Artymyshyn RL, Katanik MT, Weinstein MP. Detection of Pneumocystis jiroveci in respiratory specimens by four staining methods. J Clin Microbiol. 2004 Jul;42(7):3333-5. PubMed PMID: 15243109; PubMed Central PMCID: PMC446244.

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